니트로사민 변이원성 평가법 4

in vivo 유전독성 시험: OECD TG 488 전이형 설치류 돌연변이시험과 TG 470 Pig-a 유전자 돌연변이시험 비교

Nitrosamine 불순물 평가를 위해서는 먼저 enhanced Ames 시험(박테리아 유전자 역돌연변이시험)을 실시하며, 이때 음성 결과가 도출되고, acceptable intake limit을 1500ng/day를 초과하여 설정하고 싶은 경우, FDA는 in vivo 유전독성시험을 추가로 요구합니다.

 

OECD TG 488 전이형 설치류 돌연변이시험

목적: 체내에서 물질이 체세포 및 생식세포 수준에서 유전자 돌연변이를 일으키는지를 평가합니다.
원리: 전이 벡터(transgene)(예: λgt10‐lacI, lacZ)가 도입된 유전자 조작 (transgenic) 쥐·생쥐에 독성 평가 대상 물질 (여기서는 니트로사민) 투여 후 조직에서 회수한 벡터 DNA를 대장균 (host Escherichia coli)에 도입해 돌연변이 빈도를 산출합니다.

사용 동물: Big Blue 마우스, Muta 마우스/랜트, gpt delta 라트 등, 암컷·수컷 성숙 동물(약 6–8주) 사용.
처리방법:

• 음성대조군: 용매(생리식염수, CMC 등) 투여.
• 양성대조군: EMS(에틸메탄설폰산) 80 mg/kg/day, 28일 반복 투여 후 3일 회복.
• 시험군: 물질 3개 용량군(최대 MTD 이하) 28일간 매일 투여, 마지막 투여 후 3일간 비투여.
  판독법: 조직(간, 위, 폐 등)에서 유전체 DNA 정제→벡터 회수→대장균 접종 후 2–4일 배양해 돌연변이 클론 수 및 총 클론 수 계수.
  판정기준:

돌연변이 빈도(mutant frequency, MF) = 돌연변이 클론 수 / 총 클론 수.

음성대조군 MF의 역사적 범위 초과 및 통계적 유의성(p<0.05, ANOVA) · 농도반응 확인 시 “양성”.
특이사항:

• 체세포와 생식세포(정자) 분석 병행 가능.
• 동물복지 차원에서 동일 동물에서 여러 조직 시험 허용.

 

생쥐를 이용한 독성시험은 니트로사민 변이원성의 강력한 근거가 됩니다.

 

OECD TG 470 Pig-a 유전자 돌연변이시험

목적: 말초혈액 적혈구에서 Pig-a 유전자 돌연변이를 비침습적·연속적으로 모니터링합니다.
원리: Pig-a 유전자는 GPI(당지질) 앵커 단백질 합성에 필수로, 돌연변이 시 적혈구 표면 GPI-anchored 단백질(CD59, CD24 등) 결손으로 구별됩니다. 유세포분석(flow cytometry)을 통해 mutant phenotype 비율을 정량합니다.
사용 동물: Sprague-Dawley 랫드, C57BL/6 마우스 등(수컷·암컷, 8–12주).
처리방법:

• 음성대조군: 용매 투여.
• 양성대조군: ENU(75 mg/kg 단회), 사이클로포스파마이드(40 mg/kg) 등 mutagen 단회 또는 반복 투여.
• 시험군: 물질 3개 용량군(최대 MTD 이하) 28일 반복 투여.
• 혈액채취: 기초치, 투여 종료 시, 투여 후 1, 2, 4주째 소량(20–100 μL) 반복 채취 가능.

 

판독법:

1. 적혈구를 항-CD59(또는 CD24) 형광항체로 표지
2. 흐름세포분석으로 mutant RBC(per 10⁶ erythrocytes) 계수
3. wild-type 대비 mutant율 (%) 산출
   
   

판정기준:

• 대조군 대비 mutant율 2배 이상 증가 및 농도의존성 확인 시 “양성”
• 통계분석(ANOVA 또는 Dunnett’s test, p<0.05) 수행.
  특이사항:
• 비치명적(비도축) 시험으로 3Rs(Replacement, Reduction, Refinement) 충족
• 혈액만으로 반복 모니터링 가능, in vivo 변이 동역학(day–months) 관찰

 

두 시험 간 비교

공통점:

• in vivo 조건에서 대사·분포·DNA 수리 과정을 모두 반영
• 음성·양성 대조군 설정, 다용량군 반복 투여(≥28일) 후 평가
  
  

차이점:

• TG 488은 벡터 회수→미생물 돌연변이 스크리닝으로 gene mutation frequency 정량
• TG 470은 혈액흐름세포분석으로 mutant RBC 비율 측정, 비침습적이며 반복 측정 가능
• TG 470은 동물 희생 없이 longitudinal 모니터링 가능, TG 488은 조직 분석 위해 희생

 

이 두 시험은 유전독성 위험관리에서 상호 보완적 도구로 활용됩니다. TG 488은 조직 특이적 돌연변이 검출에, TG 470은 적혈구 기반 종합적 변이 모니터링에 장점이 있습니다.

 

대표적 소분자 니트로사민 평가 결과

NDMA (N-Nitrosodimethylamine)는 두 시험에서 모두 일관된 양성 결과를 보입니다:

• TG 488 시험: 0.02–4 mg/kg/day 용량으로 28일 투여 시 간 조직에서 용량 의존적 MF 증가(2–5배). 2 mg/kg 이상에서 통계적 유의성 확인.
• TG 470 시험: 단회 투여(75 mg/kg) 후 4주째 mutant 적혈구 비율 3배 증가, 농도의존성 관찰.

NDEA(N-Nitrosodiethylamine), NPYR(N-Nitrosopyrrolidine)도 유사한 양성 반응을 나타내며, 특히 간·폐 등 대사 활성화가 높은 조직에서 뚜렷한 돌연변이 유발이 확인됩니다.

 

참고문헌

CDER Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits (2025.06.30 접속)

OECD TG 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays (2022)
OECD TG 470: Mammalian Erythrocyte Pig-a Gene Mutation Assay (2025)

Anthony M Lynch et al., Mutagenesis. 2024 Jan 6;39(2):96–118

S Y Brendler et al., Carcinogenesis 1992 Dec;13(12):2435-41.