니트로사민 변이원성 평가법 1

일반적인 변이원성 불순물 (mutagenic impurity)의 변이원성을 평가할 때는 Ames assay라는 방법을 사용하지만, 니트로사민의 특수성 때문에 규제당국은 Ames assay에 약간의 수정사항을 적용한 Enhanced Ames assay를 권고합니다. 이 글에서는 둘의 차이를 자세히 살펴봅니다.

 

Ames Assay와 Enhanced Ames Assay 시험절차 비교

목적

표준 Ames Assay: 화학물질의 돌연변이 유발 가능성을 평가하여 잠재적 발암성을 예측하는 것을 목적으로 합니다. ICH M7 및 OECD 471 가이드라인에 따라 의약품 불순물의 유전독성을 스크리닝하는 표준 시험법입니다.

Enhanced Ames Assay: 니트로사민과 같이 표준 조건에서 민감도가 떨어지는 특수 화합물의 돌연변이성을 보다 정확히 검출하기 위해 개발된 향상된 시험법입니다. 특히 NDSRI(Drug Substance Related Impurities)의 위험평가에 필수적입니다.

 

원리

표준 Ames Assay: 히스티딘 합성 능력이 결여된 돌연변이 살모넬라균(his-)을 사용하여, 시험물질이 역돌연변이를 유발해 히스티딘 합성 능력을 회복(his+)시키는지 평가합니다. 역돌연변이가 일어난 세균만이 히스티딘이 없는 배지에서 생존하여 집락을 형성할 수 있습니다.

Enhanced Ames Assay: 동일한 기본 원리를 사용하나, 니트로사민의 대사 활성화를 극대화하기 위해 최적화된 조건을 적용합니다. 특히 30% 농도의 햄스터 및 쥐 간 S9을 사용하여 CYP2E1, CYP2A6 등 니트로사민 대사에 중요한 효소 활성을 강화합니다.

 

Ames assay는 돌연변이를 일으킨 세균만이 살아남는 원리를 이용합니다.

 

왜 S9를 첨가하는가?

Ames 시험은 본래 박테리아가 화합물을 직접 돌연변이원(mutagen)으로 인식하는지 평가합니다. 그러나 많은 발암성 전구물질(pro‐mutagen)은 체내 대사 과정을 거쳐야만 실제 DNA를 손상시키는 돌연변이 활성 물질(mutagenic metabolite) 로 전환됩니다. 이때 시험 시스템에 S9 분획(S9 fraction) 을 첨가하면, 실험실에서도 사람이나 실험동물 간의 간(liver)에서 일어나는 대사 활성화를 모사할 수 있습니다.

S9 분획은 간 조직을 균질화하고 9,000 g로 원심분리하여 얻은 상층액(supernatant)으로, 미세소체(microsomes)와 세포질(cytosol)이 함께 포함됩니다. 미세소체 성분에는 CYP450 계열 효소(CYP2E1, CYP2A6 등)와 기타 산화·환원 효소가, 세포질 성분에는 전이효소(transferases) 등 2단계 대사 효소가 존재합니다. 이들 효소가 시험 화합물을 대사하여, 본래 활성은 약하지만 체내에서 강력한 DNA 알킬화제(예: 알킬디아조늄 이온)로 전환시키면 박테리아에서 돌연변이 반응이 관찰됩니다. rat liver S9를 사용하면 니트로사민이 α-하이드록시 니트로사민으로 전환되고, 이어 분해되어 메틸디아조늄 이온이 방출되며 DNA 구아닌 잔기에 O⁶-메틸구아닌 부가물을 형성합니다. 이로 인한 G→A 치환 돌연변이가 Ames 시험에서 검출됩니다. S9 처리 없이 시험하면, 이러한 활성 대사산물이 생성되지 않아 니트로사민의 돌연변이성이 과소평가될 수 있습니다.

 

사용되는 미생물

표준 Ames Assay: OECD 471에 따라 5종의 균주를 사용합니다:

• Salmonella typhimurium: TA1535, TA1537(또는 TA97a), TA98, TA100
• Escherichia coli: WP2 uvrA (또는 WP2 uvrA pKM101)

Enhanced Ames Assay: 표준 5종 균주를 기본으로 하되, 일부 프로토콜에서는 추가 균주를 포함하여 더 넓은 범위의 돌연변이 유형을 검출합니다. 예를 들어, 일부 실험실에서는 E.coli WP2 uvrA pKM101 균주를 추가로 사용합니다.

양성/음성 대조군 및 시험군 처리방법

표준 Ames Assay:

• 음성 대조군: 시험물질 없이 용매(물, DMSO, 아세톤 등)만 처리
• 양성 대조군: 균주별 특이적 돌연변이원 사용
• S9 농도: 표준적으로 10% 농도 사용
• 전처리: 20분간 37°C에서 전배양(pre-incubation)

 

Enhanced Ames Assay:

• 음성 대조군: 표준 시험과 동일하나, 유기용매 사용 시 대사 활성화 방해를 최소화
• 양성 대조군: 표준 양성대조군 + 2종의 니트로사민 양성대조군 필수 포함
• S9 농도: 30% rat liver S9 및 30% hamster liver S9 병용
• 전처리: 30분간 37°C에서 전배양으로 연장

 

 

시험결과 판정 기준

표준 Ames Assay:

• 양성 기준: 대조군 대비 2-3배 이상 집락수 증가
• 농도-반응 관계: 용량 의존적 증가 확인 필요
• 재현성: 확증시험에서 동일한 결과 재현
• 배양 조건: 37°C에서 48-72시간 배양

Enhanced Ames Assay:

• 기본 판정 기준: 표준 시험과 동일한 2-3배 증가 기준 적용
• 민감도 향상: 30% 햄스터 S9 사용 시 니트로사민 검출 민감도 90%, rat+hamster S9 병용 시 93%까지 향상
• 특이도: 표준 시험 대비 특이도는 약 45%로 감소(위양성 증가)
• 니트로사민 양성대조군: 동시 수행된 니트로사민 양성대조군에서 양성 결과 확인 필수. 동일 화합물의 S9 무처리군 에서는 집락 수가 증가하지 않다가, S9 처리군 에서만 유의미한 증가가 나타나면 “대사 활성화 의존(mutagen activation-dependent) 양성” 으로 해석합니다.

 

각각의 특이사항

표준 Ames Assay의 특이사항:

• 국제 표준화: OECD 471, ICH M7에서 공식 인정된 표준 방법
• 비용 효율성: 상대적으로 저렴하고 신속한 스크리닝 가능
• S9 제한: Aroclor 1254 유도 rat liver S9(10%) 사용으로 일부 화합물의 대사 활성화 제한
• 니트로사민 한계: 일부 니트로사민에서 위음성 결과 가능성

Enhanced Ames Assay의 특이사항:

• 니트로사민 특화: FDA, EMA에서 니트로사민 평가를 위해 권고하는 방법
• 대사 최적화: Phenobarbital/β-naphthoflavone 유도 S9을 30% 고농도 사용
• 이중 S9 시스템: rat S9과 hamster S9을 별도로 평가하여 보수적 결과 도출
• 높은 민감도: 표준 조건에서 검출되지 않는 약한 돌연변이원까지 검출 가능
• 위양성 위험: 높은 민감도로 인한 위양성률 증가, 전문가 판단 필요
• 복잡성: 표준 시험 대비 복잡한 프로토콜과 해석 과정

 

참고문헌

FDA: Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs, Guidance for Industry, Revision 2 (September 2024)

EMA: Questions and Answers on CHMP Article 5(3) Referral on Nitrosamine Impurities, Rev. 22 (July 2023)

ICH M7(R1): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals (May 2017)

OECD 471 Bacterial Reverse Mutation Test

Jessica Dieckhoff et al., Toxicol Rep. 2024 Jan 26;12:215–223