니트로사민 생성 가능성: RNA 의약품

RNA 의약품(mRNA, siRNA 등) 제조공정은 주로 비생물학적, 무세포적(enzymatic, cell-free)방식으로 이뤄집니다. 이 과정에서 니트로사민이 생성될 수 있는 위험은 전통적 합성의약품에 비해 낮지만, 원료·첨가제·포장재 등 외부 요인과 일부 공정 조건에 따라 완전히 배제되지는 않습니다. RNA 의약품 drug substance(DS) 및 drug product(DP) 제조공정의 단계별 특징과 니트로사민 생성 가능성, 그리고 각 단위공정의 조건이 니트로사민 형성에 미치는 영향에 대해 구체적으로 살펴봅니다.

 

RNA 의약품 제조공정 단계 및 생산 조건

1) 플라스미드 DNA 증폭 및 정제

재료: 플라스미드 DNA, E. coli 배양배지(아미노산, 버퍼, 항생제), 제한효소, 버퍼

장비: 발효조, 원심분리기, 크로마토그래피 시스템

조건: 30~37°C, 중성 pH, 무산소/호기성, 무균 환경

특징: 배지 내 아민류(글루타민, 히스티딘 등) 존재 가능, 제한효소·정제용 레진에 미량 아민류 또는 nitrite 불순물 혼입 가능성

2) DNA 선형화 및 in vitro 전사(in vitro transcription)

재료: 선형화 플라스미드, NTP(ATP, GTP, CTP, UTP), RNA polymerase(T7 등), 버퍼(트리스, MgCl₂, DTT), capping reagent

장비: 반응기, 인큐베이터, 냉각기

조건: 37°C, pH 7.5~8.0, 2~4시간 반응

특징: 트리스·DTT 등 일부 버퍼/환원제에 2차/3차 아민 불순물 혼입 가능성, 상업용 NTP·효소에 미량 nitrite 불순물 존재 가능

3) RNA 정제 및 농축

재료: 크로마토그래피 레진(음이온교환, HIC 등), UF/DF 멤브레인, 버퍼(포스페이트, 시트레이트 등)

장비: 크로마토그래피 시스템, UF/DF 장치

조건: 2~25°C, 중성~약산성 pH

특징: 정제공정에서 저분자 불순물(아민, nitrite 등) 대부분 제거되나, 레진에 남은 불순물 또는 세척 미흡시 미량 남을 수 있음

4) LNP(지질나노입자) 캡슐화

재료: 이온화 지질, 콜레스테롤, PEG-지질, 부형제(트레할로스, 만니톨 등), 완충용액

장비: 마이크로믹서, 초음파기, 여과기

조건: 2~8°C, 중성 pH, 무균

특징: 일부 이온화 지질(양이온성 아민 포함)에서 2차/3차 아민 가능성, 완충용액에 미량 nitrite 혼입 가능성

5) 제형화 및 여과

재료: 완충용액, 안정화제, 보존제(폴리소르베이트, 설탕 등)

장비: 제형조제기, 0.22μm 필터

조건: 2~8°C, 무균, 저습

특징: 첨가제 중 nitrite, 아민류 미량 존재 가능성

6) 충전/밀봉(Filling/Sealing)

재료: 유리 바이알, 프리필드 시린지, 고무마개(엘라스토머), 실링제

장비: 충전기, 밀봉기, 무균충전실

조건: 2~8°C, 무균, 저습

특징: 고무마개, 실링제 등에서 미량 아민류/아질산염 용출 가능

 

RNA 치료제 제조공정에도 니트로사민 생성이 생성될 수 있는 여러 가능성이 숨어있습니다.

 

공정별 2차/3차 아민 및 nitrosating agent 유입 경로

• 플라스미드 증폭/정제: 배지·정제용 레진·효소에 미량 아민류, nitrite 불순물 가능성(공급사 COA 확인 필요)
• IVT 반응: 트리스(2차 아민), DTT(티올 환원제), 상업용 NTP, 효소에 미량 아민류, nitrite 불순물 가능성
• 정제/농축: 크로마토그래피 레진(특히 DEAE, Q-레진 등)에서 2차/3차 아민 잔류 가능성, 버퍼 제조용 원수에 nitrite 혼입 가능성
• LNP 캡슐화: 양이온성 지질(예: DOTAP, DODAP 등)은 2차, 3차 아민 구조 포함 가능, 부형제(트레할로스, 만니톨 등) 제조공정에 nitrite 불순물 가능성
• 포장재: 고무마개(디티오모르폴린 등 가황촉진제), 실링제(니트로셀룰로오스 등)에서 아민, nitrosating agent 용출 가능

 

단위공정별 니트로사민 형성 반응 촉진 조건

DNA 증폭/정제, IVT: 대부분 중성~약알칼리 pH, 30~37°C, 고수분 환경으로, nitrosamine 생성에 필요한 산성·고온 조건이 부재. 그러나 만일 정제용 레진 세척이 미흡하거나, 공급원에서 nitrite가 혼입된 경우, 2차/3차 아민과 nitrite가 동시에 존재할 수 있음.

정제/농축: 저온(2~8°C), 중성 pH, 고수분 환경으로 니트로사민 생성 위험 낮음. 단, 산성 버퍼(pH 5 이하) 사용 시, 미량 nitrite와 아민류가 반응할 수 있는 가능성 존재.

LNP 캡슐화/제형화: 중성 pH, 저온에서 진행되어 위험 낮음. 단, 양이온성 지질(아민류)과 nitrite가 동시에 존재할 경우, 산성화(예: pH 5 이하) 시 니트로사민 생성 가능성 이론적으로 존재.

충전/밀봉: 2~8°C, 무균, 저습 환경에서 진행되어 nitrosamine 생성 위험은 극히 낮음. 단, 고무마개 등 포장재에서 미량 아민/아질산염이 용출될 경우, 장기 저장 중 산성화·고온 노출 시 반응 가능성 있음.

 

결론 및 관리 전략

RNA 의약품 제조공정은 전반적으로 중성 pH, 저온, 고수분 환경에서 진행되어 니트로사민 생성 위험이 낮으나, 원료·첨가제·포장재의 품질관리 미흡, 산성화, 고온, 건조 환경의 우발적 발생, 공정 중 2차/3차 아민과 nitrite 동시 존재
등의 요소가 겹칠 경우 미량 니트로사민 생성 가능성이 있습니다.
따라서 공급사 COA 확인, 원료·첨가제·포장재의 nitrite/아민류 불순물 분석, 산성 조건 회피, 공정 후 적절한 세척·정제·purge가 필수적입니다.

 

참고문헌

ACS OPRD, Nitrosamine Risk Assessments in Oligonucleotides (2022)

Anne-Cécile V. Bayne et al., N-nitrosamine Mitigation with Nitrite Scavengers. Journal of Pharmaceutical Sciences (2023)

FDA, Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs (2024)

Justin Moser et al., N-Nitrosamine Formation in Pharmaceutical Solid Drug Products. J Pharm Sci. 2023 May; 112(5):1255-1267

Aldevron LLC, mRNA Manufacturing: Drug Substance Production (2022)