니트로사민 변이원성 평가법 3

Nitrosamine 불순물 평가를 위해서는 먼저 enhanced Ames 시험(박테리아 유전자 역돌연변이시험)을 실시하며, 이때 음성 결과가 도출되고, acceptable intake limit을 1500ng/day 으로 설정하고 싶은 경우, FDA는 in vitro 대사 활성화 시험을 추가로 요구합니다. in vitro 대사 활성화 시험은 니트로사민이 자체로 돌연변이 활성을 보이지 않으나, 체내 간 대사 효소에 의해 활성 돌연변이 물질로 전환될 때 유전독성을 발현할 가능성이 높은 경우 사용됩니다. 예컨대 Ames 시험이 음성이지만 구조경고(structure alert)가 있는 니트로사민에 대해 추가 위험 평가가 필요할 때 적용됩니다. 이 시험의 목적은 니트로사민이 간세포에서 대사 활성화를 통해 생성한 α-하이드록시니트로사민 또는 니트로사미드 대사산물이 DNA를 손상시키는지를 평가하여, in vivo 위험성 예측과 허용섭취량(AI) 설정의 과학적 근거를 제공하는 데 있습니다.

 

니트로사민 불순물의 안전성을 더 확실하게 확인하기 위해 in vitro metabolic activation assay를 수행합니다.

 

시험 원리 및 검출 대상

니트로사민은 CYP450 효소(주로 CYP2E1, CYP2A6)에 의해 α-수산화 대사(α-hydroxylation)를 거쳐 불안정한 α-하이드록시니트로사민을 형성하고, 이들이 분해되어 메틸디아조늄이나 에틸디아조늄 이온 같은 DNA 알킬화 전구체로 전환됩니다. 본 시험은 이 전구체들이 유발하는 두 가지 주요 유전독성 손상을 검출합니다.

 

DNA 단일가닥 절단(Comet assay): Comet Assay(단일세포 젤 전기영동법)는 개별 세포 내 DNA 손상을 정량화하는 민감한 분석법입니다. 먼저 현미경 슬라이드 위에 저농도 아가로스 겔에 세포를 고정하고, 세포막과 단백질을 제거하는 용해(buffer, pH 10) 과정을 거쳐 핵(nucleoid)만 남깁니다. 이후 알칼리성 전기영동을 실시하면, DNA 가닥 절단 부위로부터 단편화된 DNA가 전기장 방향(양극)으로 이동하여 ‘꼬리(tail)’를 형성합니다. 꼬리의 길이와 꼬리에 분포한 DNA 비율 비인 ‘Tail Moment’을 이미지 분석으로 산출하면, 세포당 DNA 단일가닥 절단 정도를 정량할 수 있습니다. 이 방법은 단일·이중 가닥 절단, 알킬화에 의한 DNA 손상, 교차결합(cross-link) 등 다양한 손상 유형을 검출할 수 있으며, 검사물질의 농도·노출 시간별 DNA 손상 정도 및 복구 효율을 모니터링하는 데 활용됩니다.

 

염색체 이상(Micronucleus assay): 세포분열 중 분리되지 못한 염색체 조각 또는 전체 염색체가 딸세포 밖에 남아 미세핵을 형성하는 현상을 계수합니다. 미세핵 빈도는 염색체 조각 수준의 큰 이상(클래스토제닉) 및 염색체 수 변화(에뉴제닉) 모두를 포착합니다.

 

사용 세포 및 처리 조건

• 세포주: 인간 유래 HepaRG(immortalized) 또는 1차 human hepatocyte. HepaRG는 CYP2E1·CYP2A6 등 간 특이적 효소를 발현해 in vivo 대사 활성화를 효과적으로 모사합니다. 3D 스페로이드 배양 시 효소 활성이 2D 대비 3–5배 증가해 민감도를 높입니다.
• 전처리: 0.5% DMSO 처리로 세포 안정화 후 24시간 배양.
• 대사 활성화: rat liver S9(phenobarbital/β-naphthoflavone 유도) 10% (v/v) 첨가.

 

대조군 및 시험군

• 음성 대조군: 용매(배지 또는 DMSO)만 처리.
• 양성 대조군:

  Comet assay: EMS(에틸메탄설폰산) 1 mM 처리.

  Micronucleus assay: 사이클로포스파미드(CP) 5 μg/mL + S9 처리.

• 시험군: 니트로사민 1–100 μM 농도 구간에서 24시간 노출.

 

 

검출 방법 및 수행 절차

Comet assay

1. 세포를 0.7% 저녹점 아가로스에 임베딩.
2. 용해(buffer, pH 13) 후 20분간 알칼리성 용출로 DNA 단일가닥 절단 노출.
3. 25 V 전기영동 20분, SYBR Green 염색.
4. 형광현미경 촬영 후 image analysis로 Tail moment 계산.

 

Micronucleus assay (OECD TG 487)

1. 처리 후 시토칼라신-B(3 μg/mL)로 세포분열 차단, binucleated cell 생성.
2. Giemsa 또는 DAPI 염색, 광학현미경으로 2,000개 binucleated cell당 미세핵 함유 세포 수 계수.
3. 미세핵은 핵 지름의 1/3 이내, 주핵과 동일 염색 패턴을 기준으로 식별.

 

시험결과 판정 기준

• Comet assay: Tail moment이 음성 대조군 대비 2배 이상 증가(p<0.05, t-test 또는 ANOVA) 시 “양성”으로 판정.
• Micronucleus assay: 시험군 미세핵 빈도가 역사적 음성 범위를 초과하고, 농도 의존적 증가가 확인되면 “양성”으로 평가.
• 세포독성: 생존율 ≥ 50% 범위에서 결과 해석; 과도한 세포독성(생존율 < 40%) 농도는 해석 배제.

 

기타 특이사항

• 대사 활성화 확인: LC-MS/MS로 α-하이드록시 니트로사민 대사체 정량 병행 권장.
• 3D vs 2D 모델: 3D HepaRG 스페로이드는 2D 모델 대비 민감도·재현성이 우수하나, 배양 복잡성과 비용이 증가.
• 규제 연계: ICH S2(R1) 가이드라인에 따라 in vivo 시험 전 상기 in vitro 결과를 종합하여 위험성 평가.

이와 같이 in vitro 대사 활성화 시험은 니트로사민의 대사 의존적 유전독성을 효율적으로 검출하고, 허용섭취량 설정 및 공정 개선을 위한 과학적 근거를 제공합니다.

 

 

참고문헌

CDER Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits (2025.06.30 접속)

Carlson ES, Upadhyaya P, Hecht SS. A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s. J Vis Exp. 2017;(127):56312.

Zhao L et al. Revisiting the mutagenicity and genotoxicity of N-nitrosopropanolol in TK6 cells. Mutat Res. 2023.

Muruzabal D et al. Validation of the in vitro comet assay for DNA cross-links and altered bases detection. Arch Toxicol. 2021;95:2825–2838.

OECD TG 476: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests. OECD Publishing, 2016.

OECD TG 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Publishing, 2016.