니트로사민

니트로사민 변이원성 평가법 2

멍석사 2025. 7. 8. 21:17

Nitrosamine 불순물 평가를 위해서는 먼저 enhanced Ames 시험(박테리아 유전자 역돌연변이시험)을 실시하며, 이때 음성 결과가 도출되고, acceptable intake limit을 1500ng/day 으로 설정하고 싶은 경우, FDA는 in vitro 포유류 세포 돌연변이 시험(예: OECD TG 476)을 추가로 요구합니다. 이 시험은 돌연변이성 돌연변이를 직접 정량함으로써 nitrosamine이 세포 수준에서 유전독성을 나타내는지 평가하는 것을 목적으로 합니다. 특히 N-nitrosodimethylamine (NDMA)과 같은 소분자 니트로사민은 체내 대사 활성화가 필요하므로, 세포 돌연변이 시험에서 Ames 시험으로 확인되지 않은 돌연변이성 위험을 보완적으로 검출할 수 있습니다. ICH M7 가이드라인에서도 mutagenic impurity 관리 옵션 중 Option 2(추가 in vitro 시험)를 권고하며, nitrosamine의 경우 Option 2가 반드시 적용됩니다.

 

불순물의 안전성을 더 확실하게 확인하기 위해 in vitro mammalian cell assay를 수행합니다.

 

HPRT 및 TK 유전자가 OECD TG 476 시험에서 선택된 이유

1. HPRT 유전자의 핵심 장점

  • 돌연변이 스펙트럼 감지 범위:
    HPRT     유전자는 포유류 세포의 X 염색체에 위치하며, 점돌연변이(단일염기 치환), 프레임시프트(삽입/결실), 작은 결실 등 다양한 DNA 손상 유형을 검출할 수 있습니다. 이는 니트로사민이 유발하는 O⁶-알킬구아닌 등 DNA 부가물이 주로 작은 규모의 변이를 일으키기 때문에 최적입니다.
  • 선택적 검출 메커니즘:
    HPRT     효소가 정상인 세포는 6-티오구아닌(6-TG)이 포함된 배지에서 사멸하나, HPRT 유전자 돌연변이 세포는 6-TG에 내성을 보여 집락 형성으로 쉽게 식별됩니다. 이는 고처리량 스크리닝에 적합합니다.
  • 인간 세포 적용 가능성:
    인간 림프모구(TK6 세포) 등에서 직접 시험이 가능해 인체 유전독성 예측 정확도가 높습니다.

2. TK 유전자의 보완적 역할

  • 대규모 유전적 변이 감지:
    TK     유전자는 자가염색체(autosome)에 위치해 큰 결실, 유전자 재조합, 미토틱 비분리 등 HPRT가 검출하지 못하는 대규모 변이를 포착합니다. 니트로사민의 장기 노출 시 발생 가능한 염색체 수준 손상을 평가하는 데 필수적입니다.
  • 이중 기능 유전자 특성:
    TK     유전자는 DNA 합성에 관여하므로 돌연변이 시 세포 생존율 변화가 뚜렷해 정량적 판정이 용이합니다.

3. 두 유전자를 함께 사용하는 과학적 이유

  • 상보적 스펙트럼 커버리지:
    HPRT    는 X 염색체의 단일 복제본 특성상 큰 결실 변이 검출에 한계가 있으나, TK는 이를 보완합니다. 반면 TK는 작은 점돌연변이 감도가 HPRT보다 낮아 둘의 병용이 최대한의 변이 유형 포괄을 가능케 합니다.
  • 규제 가이드라인의 명시적 권고:
    OECD TG 476    은 화학물질의 유전독성 프로필 완전성을 위해 HPRT와 TK(또는 XPRT)의 병행 사용을 지시합니다. 특히 니트로사민은 다양한 변이 기전을 유발하므로 이 조합이 필수적입니다.

 

사용 세포주 및 처리 조건

시험에는 CHO, V79, CHL(Chinese hamster), L5178Y(쥐 림프종), TK6(인간 림프모구) 등 영구 분열(immortalized) 능력이 확립된 세포주를 사용합니다. 이들 세포주는 높은 세포 적합성, 낮은 기형 돌연변이율, 안정된 염색체 수를 특징으로 합니다. 시험군 처리 시에는 최소 4개 농도를 설정하고, S9 분획(10% v/v) 유무로 대사 활성화를 평가합니다. S9 분획은 phenobarbital/β-naphthoflavone 유도 rat liver 상청부로, CYP2E1·CYP2A6 등 효소를 포함해 니트로사민을 활성 돌연변이 물질로 전환시킵니다. 세포는 처리 후 3–6시간 노출·배양한 뒤, 7–9일간 표현기(phenotypic expression) 기간을 거쳐 돌연변이가 발현되도록 합니다.

 

양성·음성 대조군 및 검출·판정 기준

음성 대조군은 용매(증류수, DMSO 등)만 첨가한 세포주를, 양성 대조군은 HPRT 음성 시 EMS(에틸메탄설폰산), ENU(에틸엔드옥시유레아), S9 활성화 시 Benzo[a]pyrene, 2-aminoanthracene 등을 활용해 시험 시스템의 민감도를 검증합니다. 처리 이후 6-thioguanine 선택배지에서 돌연변이 세포만이 생존하여 집락을 형성하며, 비선택배지에서는 생존율(CI)을 측정해 세포독성을 평가합니다. 돌연변이 빈도(mutant frequency)는 “선택배지 집락수 ÷ 비선택배지 생존 세포수”로 산출합니다.

시험 결과 판정은 다음 기준에 따라 이루어집니다:

  1. 통계적 유의성: 대조군 대비 집락수가 2배 이상 증가(p<0.05).
  2. 농도 의존성: 농도-반응 관계 확인.
  3. 역사적 음성 통제 한계: 연구실 고유의 역사적 음성 통제 범위를 벗어남.

이 세 가지 조건이 모두 충족되면 “양성(mutagenic)”으로, 모두 부합되지 않으면 “음성(non-mutagenic)”으로 평가합니다.

 

특이사항 및 추가 고려사항

  • 세포독성 과다 방지: RS가 20–10% 범위 내에서 농도 선택, 10% 이하 집락은 과도한 세포독성으로 간주해 해석에 주의가 필요합니다.
  • 불용성 물질: 침전이 관찰되면 1농도만 시험하거나, 시험 전 용매 안정성 확인이 필수적입니다.
  • 역사적 대조 데이터: 10회 이상의 역사적 음성/양성 대조 데이터를 확보해 신뢰도를 높여야 합니다.
  • 비임상-임상 연계: 결과가 임상 노출 예측과 연결될 수 있도록 약동학·대사 정보도 함께 고려합니다.

이와 같은 in vitro 포유류 세포 돌연변이 시험은 nitrosamine의 돌연변이 유발 잠재력을 체계적으로 평가하여, 안전한 허용섭취량 설정 및 환자 노출 평가를 위한 중요한 과학적 근거를 제공합니다.

 

참고문헌

CDER Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits (2025.06.30 접속)

OECD TG 476: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests (2016)

Phouthone Keohavong et al., Molecular analysis of mutations in the human HPRT gene Methods Mol Biol. 2005:291:161-70

Vasily N Dobrovolsky et al., Analysis of in vivo mutation in the Hprt and Tk genes of mouse lymphocytes Methods Mol Biol. 2014:1105:255-70  (2014)